Чем отличается качественный анализ от количественного пцр

ПЦР – важнейший метод диагностики инфекционных заболеваний.

Сегодня большинство лабораторий делают анализы на ИППП и другие инфекционные патологии при помощи реакции амплификации нуклеиновых кислот. Она очень точная, позволяет диагностировать болезнь даже на начальных стадиях.

Для диагностики туберкулеза все чаще применяют именно ПЦР. Ранее болезнь можно было выявить только с помощью микроскопии или посева мокроты. Используется также ИФА для определения антител в крови. Но все эти способы менее чувствительны. Они помогают подтвердить диагноз только при наличии большого количества бактерий.

ПЦР обнаруживает туберкулез даже в доклинической стадии. В том числе в случаях, когда культуральное исследование дает ложноотрицательные результаты. Исследовать можно любой клинический материал. Это может быть мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, смывы бронхов, менструальная кровь и т.д., в зависимости от предполагаемой локализации инфекции.

ПЦР качественный на гепатит С

Анализ на гепатит Ц, если он качественный, может быть положительным или отрицательным. В ходе исследования обнаруживается РНК вируса. Это один из основных маркеров гепатита.

В ходе диагностики могут быть использованы тест-системы с разной чувствительностью. Тесты бывают малочувствительные и высокочувствительные.

Первые обходятся значительно дешевле. В этом их основное преимущество. Но в то же время они выявляют вирус лишь в концентрации от 50 МЕ/мл и более. То есть, не исключены ложноотрицательные результаты.

По рекомендации ВОЗ, диагноз гепатит С может быть установлен, если три раза проведенное исследование ПЦР обнаружило РНК вируса. Это один из наиболее ранних методов диагностики.

ПЦР становится положительной, даже когда антитела ещё не появляются. РНК в крови может быть обнаружена уже через 1-2 недели после заражения.

Существуют также высокочувствительные тесты. Таковыми считаются те, что определяют РНК при концентрации 25 МЕ/мл или меньше. Такие диагностические тесты обходятся дороже низкочувствительных в несколько раз. Но иногда необходимость в их проведении все же возникает.

Основные случаи, когда высокочувствительный тест ПЦР необходим:

• Антитела положительные, но РНК в крови не обнаруживается.

Наличие одних только антител не дает оснований установить диагноз. Потому что антитела могут говорить и о перенесенной в прошлом инфекции. Требуется подтверждения путем выявления РНК. И если концентрация её низкая, обычный тест ПЦР может дать отрицательный результат. В таком случае проводят высокочувствительный тест. Он позволяет с высокой достоверностью либо подтвердить, либо исключить диагноз.

• Наличие признаков поражения печени.

Если анализ на антитела отрицательный, а признаки поражения печени присутствуют, врач может назначить высокочувствительный тест ПЦР на гепатит С. Потому что отрицательные антитела не говорят о том, что болезни нет. Вполне вероятно, что инфицирование состоялось недавно, и АТ ещё не успели синтезироваться. Кроме того, их может не быть при иммунодефиците человека или в случае лечения иммунодепрессантами.

• Оценка эффективности терапии.

Согласно европейских рекомендаций 2015 года, для оценки вирусологического ответа на терапию должны использоваться только высокочувствительные тесты ПЦР. Данный метод диагностики используется также для выявления гепатита В. В ходе диагностики определяется фрагмент ДНК. Это самый ранний тест, позволяющий обнаружить вирус ещё на начальном этапе болезни.

ПЦР может использоваться:

• для уточнения результатов при отрицательном исследовании на HBsAg;
• в качестве скринингового теста;
• для обследования лиц, контактирующих с больным гепатитом В;
• с целью контроля лечения;
• для обнаружения обострения хронического гепатита В.

Доктор может назначить этот анализ при наличии желтухи или цирроза печени, а также в случае лабораторных признаков поражения печени. Расшифровка результатов проводится врачом.

ПЦР количественный гепатит С

В некоторых случаях проводится количественный анализ ПЦР на гепатит С. По итогам исследования доктор получает числовое значение. Оно определяет вирусную нагрузку. Расшифровать анализ не трудно. Возможные такие результаты:

• вирус не обнаружен;
• вирус обнаружен, его концентрация составляет менее 100 МЕ/мл;
• вирус обнаружен, концентрация указывается в числовом выражении от 100 до 100 миллионов МЕ/мл;
• вирус выявлен в количестве более 100 миллионов МЕ/мл.

Назначается такое исследование в основном перед началом лечения для определения оптимальной терапевтической тактики. Кроме того, в процессе терапии оценка вирусологической нагрузки позволяет оценить эффективность применения медикаментозных средств.

На гепатит Б тоже проводится количественный тест ПЦР. Показания – аналогичные.

Метод выявления генотипа вирусов с помощью реакции амплификации нуклеиновых кислот используется также при многих других патологиях. Например, при папилломавирусной инфекции.

Сам факт наличия ВПЧ в организме установить нетрудно. Для этого достаточно осмотра – на коже и слизистых появляются бородавки или кондиломы. Но разные вирусы несут разную степень опасности. Некоторые из них всего лишь доставляют психологический дискомфорт, провоцируя появления бородавок. В то же время другие грозят злокачественными онкологическими новообразованиями. Чтобы понять, чего можно ждать от вируса, проводится ПЦР на онкогенные типы. В основном это типы 16, 18, а также 31 и 33.

Есть и более углубленные исследования. Они предполагают дополнительное определение других типов ВПЧ высокого онкогенного риска.

Зачем это нужно?

При обнаружении опасных вирусов избавиться от них все равно невозможно. Потому что не существует пока что препаратов, уничтожающих ВПЧ полностью. Но пациента с угрозой появления злокачественных новообразований берут под контроль. Он регулярно наблюдается у доктора.

В большинстве случаев рак не появляется на пустом месте. Особенно если речь идет о раке шейки матки – самом частом онкологическом процессе, который запускают вирусы папилломы. Ему предшествуют диспластические изменения. Их можно своевременно выявить и вылечить. Поэтому в случае обнаружения у женщины высокоонкогенных ВПЧ, она должна регулярно сдавать мазки на онкоцитологию и проходить гинекологические осмотры.

ПЦР качественный или количественный

Качественный метод ПЦР имеет значительное отличие от количественного. Оно состоит в том, что результат выдается обнаружено или не обнаружено. Тогда как количественный дает числовое значение. Он необходим в ряде случаев. Например, чтобы оценить, прогрессирует ли болезнь (увеличилась ли вирусная нагрузка).

С помощью количественного исследования можно проверить, эффективно ли проходит терапия (уменьшилась ли вирусная нагрузка). Определяются показания к лечению заболевания. Например, при низкой концентрации патогена может применяться тактика наблюдения, а при увеличении популяции назначается лечение.

Разновидности ПЦР

Существует большое количество видов полимеразной цепной реакции. Рассмотрим некоторые из них, которые активно используются в медицине.

Real Time PCR

Одной из разновидностью ПЦР является Real Time PCR. RT PCR предполагает определение ДНК возбудителя в режиме реального времени и оценку количества копий специфических фрагментов нуклеиновых кислот. Для этого могут использоваться различные методы. В основном применяется один из двух способов:

• ДНК-зонды;
• флюоресцентные красители.

Метод очень похож на обычную ПЦР. Здесь есть все те же самые этапы. Вначале проводится денатурация ДНК. Затем – отжиг праймеров. При RT PCR детекция продукта производится по мере его накопления. Методика широко используется в различных областях медицины и науки. В первую очередь это диагностика заболеваний. С помощью ПЦР в реальном времени можно оценить вирусную или бактериальную нагрузку. Оценивается эффективность лечения – врач смотрит, уменьшилось ли количество ДНК возбудителей в организме человека. Метод применяется и в онкологии. С его помощью можно провести детекцию атипичных клеток в солидной опухоли. А также определяются циркулирующие опухолевые клетки.

Real Time PCR применяется в микробиологии. Метод используется для оценки количественных показателей нормальной микрофлоры человека, например, в кишечнике или во влагалище.

RAPD

RAPD – это не отдельный анализ. Это ПЦР-маркер. Он считается наиболее распространенным.

В ходе анализа используется единичный короткий праймер. Обычно он имеет 10 членов.

Нуклеотидная последовательность – произвольная. Иногда в RAPD используется сразу несколько праймеров.

PCR RFLP – способ определения ДНК путем её разрезания. Для этого используются ферменты эндонуклеазы рестрикции. В последующем фрагменты анализируются путем электрофореза. Метод используется для определения генов, отвечающих за различные заболевания, склонность к которым передается по наследству. А также для определения генетического родства двух людей.

ПЦР с обратной транскрипцией

Существует множество других видов ПЦР.

Реакция с обратной транскрипцией предполагает превращение РНК в одноцепочечную ДНК с помощью обратной транскриптазы. Затем проводится обычная ПЦР для анализа последовательности нуклеотидов.

Метод позволяет обнаружить РНК даже в минимальном количестве. Он применяется в диагностике ВИЧ и некоторых генетических заболеваний. Другие виды ПЦР:

• вложенная – особенностью является применение двух пар праймеров;
• инвертированная – предполагает несколько разрезаний и сшиваний ДНК, в результате чего известные фрагменты оказываются на двух концах неизвестного;
• асимметричная – предполагает использование избытка одного праймера;
• ступенчатая – проводится при температуре выше оптимальной, которая постепенно уменьшается до оптимума;
• виртуальная – проводится с помощью компьютерного анализа, который предсказывает потенциальную амплификацию ДНК.

ПЦР на герпес 6 типа

Анализ может использоваться для выявления любых вирусов. В том числе семейства герпеса.

Могут быть определены возбудители 1 и 2 типа. ВПГ 1 и 2 типа могут вызывать лабиальный или генитальный герпес. Первый чаще вызывает поражение губ. Второй – обычно вызывает воспалительные процессы мочеполовой системы.

Выявляются также:

• третий тип – ветряная оспа;
• четвертый – вирус Эпштейна-Барр;
• пятый – цитомегаловирус;
• шестой – розеоловирус;
• седьмой – провоцирующий саркому Капоши.

В нашей клинике можно обследоваться на любые инфекции методом ПЦР. Результаты анализов можно получить быстро, и при необходимости – анонимно.

ПЦР на гепатит С – обязательный анализ при обследовании пациента с симптомами поражения печени. Исследование назначают для подтверждения диагноза и получения максимально полной информации о возбудителе болезни, активности вирусной инфекции. Результаты служат основанием для назначения противовирусной терапии, определения ее продолжительности и оценки эффективности.

Диагностика с применением методики полимеразной цепной реакции получила распространение сравнительно недавно. Исследования на эту тему велись с середины 1970-х годов. Но первые публикации относительно возможности использования ПЦР в практической медицине появились только в середине 1980-х гг.

При объяснении, что такое ПЦР, врачи подчеркивают, что это самый надежный и достоверный анализ при гепатите С. Данный тест позволяет не только выявить частицы РНК вируса, но и установить его концентрацию (указывает на активность инфекционного процесса) и генотип. Полученные результаты играют ключевую роль для определения тактики и схемы дальнейшей терапии.

В чем состоит суть постановки реакции? При помощи определенных биологически активных веществ добиваются увеличения количество частиц РНК вируса в небольшом объеме крови. Впоследствии участки генома определяются разнообразными физико-химическими методами.

Постановка ПЦР осуществляется при помощи нескольких компонентов:

• Праймер. Это искусственно синтезированное соединение, в котором последовательность нуклеотидов полностью идентична конкретному участку РНК вируса, не подвергающегося мутациям и изменением в зависимости от генотипа. Определение РНК вируса гепатита С выполняется с использованием строго специфичного праймера.
• РНК-полимераза. Фермент, отличающийся устойчивостью и структурной стабильностью на фоне изменений температуры, необходимых для правильного протекания химической реакции. Обеспечивает построение цепочки РНК на одном из этапов ПЦР.
• Смесь протеинов. Для построения дополнительных участков РНК необходим «строительный материал», для чего к биологическому образцу добавляют определенные соединения белковой структуры.
• Буфер. Смесь, поддерживающая оптимальный уровень рН для обеспечения протекания полимеразной цепной реакции.
• Образец биологического материала, предположительно содержащий образец РНК HCV (Hepatitis C Virus).

При некоторых способах постановки ПЦР дополнительно используются РНК-зонды и другие внутренние контроли, используемые в качестве контрольных образцов при выявлении результатов.

Сам процесс увеличения участков вирусной РНК при помощи матрицы именуют амплификацией. Реакция протекает в несколько этапов:

1. Денатурирование. Процесс «раскручивания» нитей РНК обеспечивается повышением температуры до определенного уровня.
2. Отжиг. После снижения температуры до необходимых показателей происходит присоединение праймеров к РНК. Данная стадия возможна только при наличии в образце крови искомых вирусных частиц.
3. Непосредственный синтез участков вирусной РНК с участием ферментов.

Перечисленные циклы постановки ПЦР повторяются несколько десятков раз, что обеспечивает многократное увеличение количества участков РНК возбудителя гепатита С уровня, определяемого лабораторными способами.

Перед проведением анализа образец забора крови соответствующим образом подготавливается. Содержащиеся РНК адсорбируются на буфере-носителе, затем смываются и используется для постановки полимеразной цепной реакции.

Детекция результатов проводится либо методом электрофореза (горизонтального или вертикального), либо способом гибридизации. Способ расшифровки результатов реакции выбирается исходя из целей проведения исследования (просто выявление РНК, либо определение ее ориентировочного количества).

ПЦР – самый точный анализ крови на гепатит С

Перечень предлагаемых исследований на HCV включает несколько пунктов, отличающихся по стоимости, срокам готовности и способу выполнения.

Если обратиться к протоколам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), порядок диагностики инфекции включает несколько последовательных этапов.

Для начала сдают:

• общий анализ крови и мочи;
• биохимия крови;
• исследование на содержание глюкозы (строго натощак);
• анализ на ВИЧ;
• флюорография;
• иммунограмма (при подозрении на наличие аутоиммунных патологий).

При отклонении показателей биохимического анализа крови от физиологической нормы пациенту назначают тест, основанный на обнаружении специфических антител, вырабатываемых при контакте вируса с кровью (ИФА).

Но подобный анализ крови на гепатит С имеет существенный недостаток. Процесс синтеза антител зависит от функционирования и выработки иммунокомпетентных клеток. Индивидуальные особенности организма могут стать причиной как ложноотрицательного, так и ложноположительного ответа.

Перед назначением теста ИФА врач рассказывает пациенту о возможной ошибке, что вызывает ответный вопрос: «Какой анализ крови показывает гепатит С с минимальным риском получения неверных результатов?» Для подтверждения или опровержения диагноза самым точным лабораторным тестом является проведение ПЦР методом real time.

Дальнейшая тактика действий зависит от того, что покажет исследование. В случае подтверждения диагноза, пациенту сразу же назначают гепатопротекторы, предупреждают о важности правильного питания и здорового образа жизни. Но таргетная терапия невозможна без определения уровня вирусной нагрузки и генотипа гепатита С.

Некоторые лекарственные препараты могут спровоцировать обострение гепатита В. Поэтому для исключения осложнений, дополнительно назначают анализы на HBsAg. HCV лечат только после получения отрицательного результата исследования.

Виды: качественный, количественный и генотипирование

При первичной диагностике гепатита С серологическим методом определяется титр вырабатываемых антител. Такой результат приблизительно показывает активность патологического процесса. Но максимально точную информацию доктор может получить только после изучения данных ПЦР.

В настоящее время практически во всех лабораториях анализ выполняют ультрачувствительным методом. Таким образом диагностика HCV возможно уже через 10–14 дней после заражения, реже – спустя 2,5–3 недели. В зависимости от целей, преследуемых в ходе исследования, доктор назначает конкретный тип теста.

Существуют следующие разновидности ПЦР:

1. Качественный. При назначении диагностических тестов, у пациентов возникает вопрос, что показывает подобный метод исследования. Качественный анализ способом ПЦР – высокочувствительный тест, определяющий наличие РНК вируса в крови в минимальной концентрации. Обычно подобная разновидность полимеразной цепной реакции ставится по технологии обратной транскрипции. Это один из немногих способов ПЦР, в ходе которого в качестве мишени можно использовать РНК.
2. Количественный. Количественный анализ на гепатит С позволяет определить точный уровень РНК HCV в крови. Проведение исследования возможно только одним способом – методом real-time. В ходе подготовки материала к постановке ПЦР в образец добавляют краситель. После каждого цикла амплификации проводится автоматизированное количественное исследование в режиме реального времени. Нередко методику проводят в сочетании с обратной транскрипцией. Таким образом возможно качественное определение малого количества копий РНК вируса. Устанавливать уровень РНК HCV количественно имеет смысл, если получен положительный результат качественной ПЦР.
3. Генотипирование. Анализ сдается проводится на конечной стадии диагностического процесса. Принцип исследования построен на разнице в последовательности нуклеотидов, что отличает один генотип вируса гепатита С от другого. Обычно анализ делают методом мультипраймерной (мультиплексной) ПЦР.

При подозрении на носительство вируса, необходимо выполнить качественную ПЦР. Если результат отрицательный, человек скорее всего здоров. Но для полного исключения заражения рекомендуют повторить исследование через 7–10 дней. Если же РНК вируса обнаружена, проводят дальнейшие тесты (количественный и генотипирование).

Показания к проведению лабораторного теста

Основным показанием к сдаче крови на гепатит С методом полимеразной цепной реакции является положительный результат иммуноферментного анализа (вне зависимости от разновидности: Total, дифференцированный тест на IgG и IgM).

Кроме того, провериться нужно:

• в период беременности (тест делают дважды – в первом триместре и за 7–10 недель до родов);
• при работе, связанной с повышенным риском инфицирования (медсестры, лаборанты, работники донорских центров, косметологи и т.д.);
• при беспорядочных половых связях и незащищенном контакте с малознакомым человеком;
• на фоне ВИЧ, онкологических заболеваний, приема определенных медикаментозных средств и т.д.;
• пациентам, зависимым от внутривенных наркотиков;
• при постоянном проведении инвазивных диагностических или лечебных процедур;
• при проведенном до 1992 года переливании крови (ранее не существовало достоверных способов проверки донорского биологического материала на наличие вируса).
• при соприкосновении открытой раны с чужой кровью, нестерилизованным медицинским инструментарием.

Рост заболеваемости растет с каждым годом. Поэтому для раннего выявления инфекции лабораторные тесты на HCV рекомендуют сдавать один раз в год.

Где сдать анализ

При обращении в поликлинику, пациент имеет право на бесплатные анализы. Но сначала сдают тест ИФА. И только при положительном либо сомнительном результате показано исследование методом ПЦР. Поэтому провести срочную диагностику можно обратившись в платную лабораторию, где сдать кровь на ПЦР можно в удобное для пациента время. Одновременно рекомендуют сразу проверить показатели печеночных ферментов, стандартные клинические параметры крови.

Как правило, изучение крови методом ПЦР доступно практически в любой лаборатории. Если пункт забора крови не оснащен должным оборудованием, биологический материал транспортируют для проведения исследования с соблюдением температурного режима и других условий. Проведение ПЦР в поликлинике возможно только после других обследований, результаты которых косвенно укажут на наличие гепатита С.

Как правильно сдавать кровь

Перед тем, как сдавать кровь на обнаружения возможного вируса, следует соблюсти ряд правил подготовки к анализу.

Основные аспекты указаны в памятке:

1. За 5–7 дней отказаться от потребления жирной, жареной пищи, алкоголя. В целом, доктора рекомендуют придерживаться правил питания по диете №5.
2. За 12–14 часов до проведения исследования не есть. Пить можно только воду.
3. Сдать кровь лучше в первой половине дня.
4. До процедуры не курить.

Также следует предупредить доктора о принимаемых лекарственных препаратах, возможных проблемах со здоровьем, хронических заболеваниях.

Забор крови выполняется из вены. После окончания процедуры место прокола медсестра заклеивает стерильным пластырем, предупреждает о необходимости согнуть руку и держать ее в таком положении 10–15 минут. В противном случае высока вероятность появления болезненной гематомы.

Сколько по времени делается исследование?

Сколько делается анализ, зависит от лаборатории. Средний срок выполнения колеблется в пределах 1–3 дней. Некоторые клиники предоставляют платную услугу быстрой постановки ПЦР, однако время проведения ограничивается возможностями медицинской аппаратуры.

В поликлинике результаты могут передаваться врачу в течение 7–10 дней. Это связывают с большим наплывом пациентов. При этом биологический материал хранится в соответствии со всеми требованиями.

Расшифровка результатов

Как правило, расшифровка качественной ПЦР не представляет сложности. Но во избежание ошибочной трактовки, с полученным из лаборатории бланком следует обратиться к врачу. Варианты, что означает та или иная разновидность ПЦР, приведены в таблице.

Вид исследования	Возможный результат и предполагаемая расшифровка
Качественная ПЦР

Отрицательный: человек здоров либо концентрация вирусной РНК в крови слишком мала для детекции.

Положительный: человек инфицирован

Количественная

Проводится, если обнаружено РНК вируса качественным методом исследования.

В зависимости от того, какие результаты анализов получены, определяется уровень вирусной нагрузки

Генотипирование

Проводится при гепатите С, подтвержденном другими методами исследования.

Анализ позволяет установить точный генотип возбудителя патологии

Но нередко возникает ситуация, когда ИФА на гепатит С положительный, а ПЦР отрицательный. Расшифровать такие результаты анализов может только врач.

Однако подобные данные возможны в следующих случаях:

• беременность;
• перенесенный в острой форме гепатит С;
• пройденный курс лечения от HCV;
• наличие инфекций, повышающих вероятность ложноположительного результата ИФА.

Только полимеразная цепная реакция показывает точное наличие вирусной инфекции в организме. На фоне отрицательной ПЦР положительный ИФА в большинстве случаев говорит о том, что человек не инфицирован. Но врачу следует точно установить причину ложноположительного результата.

Качественный анализ

Анализ ПЦР качественный на гепатит С подтверждает присутствие возбудителя заболевания в крови. Если РНК вируса не обнаружена, человек здоров. Но при подозрении на инфицирование рекомендуют повторно пройти исследование. Положительный результат свидетельствует об инфицировании. Но этот анализ не позволяет дифференцировать хронический гепатит С от острого, и не может показать, насколько активен патологический процесс.

Количественный тест

Количественный анализ методом ПЦР проводится после подтверждения диагноза и его расшифровка важна для определения тактики лечения. В зависимости от концентрации частиц возбудителя гепатита С выделяют несколько степеней вирусной нагрузки: средняя, высокая и низкая. Чем больше показатель, тем тяжелее протекает инфекция и сложнее терапия. В норме вирусная РНК отсутствует в крови.

Генотипирование

Многие лаборатории проводят генотипирование в комплексе с количественной ПЦР, что позволяет сэкономить. Подобное исследование делают только один раз, перед началом лечения. Обычно выполняют анализ на один из четырех наиболее распространенных генотипов (1, 2, 3 или 4). Одновременно определяют и подтип HCV. Генотипирование на 5 и 6 подвид гепатита С возможно не в каждой лаборатории.

Плюсы ПЦР диагностики

Диагностика методом ПЦР получила широкое распространение благодаря:

• высокой точности (при условии использования тест-систем последнего поколения);
• простоте забора биоматериала;
• быстроте получения результатов (максимум 5 дней).

Но основное преимущество состоит в широких диагностических возможностях исследования. Анализ позволяет не только выявить вирус, но и точно определить его концентрацию в организме и установить генотип инфекции. Кроме того, количественное исследование необходимо для оценки эффективности противовирусной терапии. Основная цель лечения – достижение нормы анализов (т. е. неопределяемого уровня РНК HCV) на 4, 12 или 24 неделе противовирусного курса и сохранение этого результата.

Стоимость

Стоимость анализа ПЦР колеблется в зависимости от региона. Так, в Москве цены выше. Качественная ПЦР обойдется в 600–800 рублей, количественная – в 2200–3000 рублей, генотипирование – от 1000 рублей. Узнать точно, сколько стоит конкретное исследование, можно непосредственно в лаборатории, на сайте медицинской организации или по телефону.

Полимеразно-цепная реакция считается одним из самых точных и быстрых методов диагностики многих инфекционных заболеваний. Успешно применяется она также в криминологии для упрощения процесса идентификации преступников, с ее помощью с высокой точностью устанавливают отцовство.

Суть метода ПЦР

Каждый живой организм, в том числе бактерии и вирусы, имеют уникальные гены, входящие в структуру ДНК или РНК в определенной последовательности. Во время исследования методом ПЦР генетический материал многократно копируется под воздействием ДНК-полимеразы и специальных температурных циклов.

Существуют два основных метода полимеразно-цепной реакции:

1. Классический метод — выделение генетического материала возбудителя методом электрофореза;
2. ПЦР в режиме «реального времени».

Методика состоит из трех основных этапов:

• Подготовка исследуемого образца;
• Амплификация ДНК;
• Детекция (идентификация) генетического материала предполагаемого возбудителя.

Для проведения исследования ПЦР-лаборатория должна быть разделена на 3 зоны, каждый этап реакции проводится строго в предназначенном для него помещении. Каждая зона должна быть снабжена необходимым оборудованием, дозаторами, расходным материалом, защитной одеждой, используемыми только в данном помещении.

После регистрации и маркировки образцов, в кабинете пробоподготовки происходит выделение ДНК или РНК возбудителя из исследуемого материала путем воздействия определенной температуры и специальных реагентов. Затем начинается процесс амплификации – создания многочисленный копий уникального фрагмента ДНК. Он состоит из 3 основных этапов:

• Денатурация ДНК – под воздействием высокой температуры (95 градусов) двойная спираль ДНК расплетается на 2 цепочки.
• Отжиг праймеров – к окончаниям цепей ДНК присоединяются специальные синтетические соединения (праймеры), идентичные генетической информации на концах искомых фрагментов нуклеиновых кислот. Температура, нужная для присоединения праймера, индивидуальна для конкретного случая, колеблется в диапазоне от 50 до 65 гр.С.
• При помощи фермента ДНК-полимеразы при 70 – 72 градусов между двумя праймерами достраивается аналогичный участок ДНК (ампликон). В качестве «строительного материала» используются специальные вещества, добавляемые в пробирку.

Циклы амплификации повторяются несколько раз, следовательно, выделяемая ДНК многократно копируется, что упрощает процесс ее идентификации. Идентификация может проводиться визуально после проведения процедуры электрофореза продуктов амплификации в агарозном геле, либо автоматически при использовании методики реал тайм.

При исследовании методом ПЦР в режиме «реального времени» амплификация и детекция происходят одновременно в специальных приборах. Данный метод наиболее предпочтительный, так как исследование проводится в закрытых пробирках, снижается риск контаминации и, следовательно, выдачи ложно-положительных результатов.

Плюсы и минусы метода

• Исследование занимает всего несколько часов, в отличие от длительных классических микробиологических методов;
• Высокая специфичность от 95% до 100%, т.к. искомый фрагмент ДНК уникален для каждого конкретного микроорганизма;
• Высокая чувствительность метода, обнаружить возбудителя можно, даже если в исследуемом образце он представлен всего одной клеткой;
• Идентифицировать возбудителя можно как качественным, так и количественным методом. Это очень важно при выделении условно-патогенных микроорганизмов, которые в небольшом количестве не вызывают заболевания;
• Возможность определить генотип возбудителя (гепатит С, ВИЧ-инфекция). Необходимо это для рационального лечения и прогноза возможных осложнений;
• Возможность выявить генетическую предрасположенность к болезни, тем самым предупредить ее развитие;
• Можно выделить практически любой источник инфекции, также современные методики позволяют выявить совокупную микрофлору в исследуемом образце, например, биоценоз влагалища.

• Возможность получения как ложноположительного, так и ложноотрицательного образца при несоблюдении правил забора образца, ошибок при проведении исследования;
• Высокая стоимость анализа.

Применение

Исследовать методом ПЦР можно практически любой образец (кровь, моча, ликвор, соскобы с цервикального канала и уретры, волосяные луковицы, сперма и т.д.). Широко используется данная методика для диагностики ЗППП (гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомониаз). С ее помощью можно выявить возбудителей туберкулеза, дифтерии, пневмонии, вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, токсоплазмоза, цитомегаловирусной и герпетической инфекции, сальмонеллеза и др.

Применяется полимеразно-цепная реакция для установления отцовства путем сравнения ДНК родителя и ребенка, выявления генетических аномалий и наследственной предрасположенности организма к различным заболеваниям.

Подготовка к сдаче анализа

• Кровь рекомендуется сдавать строго натощак.
• Перед взятием мазка из уретры или цервикального канала следует в течение трех дней воздержаться от половой жизни, сдавать анализ необходимо не раньше, чем через месяц после окончания курса антибиотикотерапии, иначе результат может быть ложноположительным. Методом ПЦР выявляется ДНК даже мертвого возбудителя, поэтому проводить исследование лучше после полного обновления клеток.
• Мочу следует собирать в стерильную емкость.

Ответ чаще всего будет готов через пару дней, в зависимости от возможностей лаборатории.

Расшифровка результатов

При использовании качественной методики может быть только 2 варианта ответа: положительный или отрицательный. Положительный результат свидетельствует о наличии выделяемого микроорганизма в образце, отрицательный – об отсутствии.

Количественный результат должен оценивать лечащий врач, применяется индивидуальный подход в каждом конкретном случае. Специалист, учитывая полученный ответ, решает вопрос о необходимости лечения, дозировке препаратов, уточняет форму и стадию заболевания.

При определении генетического профиля (предрасположенности к тромбофилии, раку молочной железы) после расшифровки результата врач может оценить степень риска развития заболевания, а также назначить специальную диету, профилактические мероприятия.

Страничка оказалась полезной? Поделитесь ею в своей любимой соцсети!