Обнаружение и идентификация pseudomonas aeruginosa
Содержание:
| Этапы иссле-дования | Патологический материал (гной, соскобы эпителия, мазки из ран, моча при цистите, молоко при мастите, фекальные массы при энтерите, кровь при сепсисе; кусочки паренхим. органов; пищевые продукты) | |
| 1 этап | Мазок (палочки, Гр-, Сп-, Капс.-, подвижные, Располагаются одиночно, беспорядочно и попарно | Посев на: · простые среды: МПА, МПБ, · кровяной агар, а также на элективные среды для энтеробактерий – Эндо, Левина |
| Изучение культурально-биохимических свойств 1.Плоские, сливающиеся, сочные колонии с изрезанными краями, поверхность колоний часто имеет матовый отблеск — «радужный лизис». Лактоза «-». 2.Выделяющийся пигмент пиоцианин в большинстве случаев окрашивает колонии и среду под ними в зеленоватый цвет) 3.При росте выделяется характерный запах «жасмина» или «земляничного мыла» Гемолитическая активность на кровяном МПА + | ||
| Дополнительное биохимическое тестирование Оксидазиая активность + (меняется цвет реактива на оксидазу) Качественная реакция на пиоцианин с хлороформом + Рост при 42 о С и отсутствие роста при 4°С Окисление глюкозы только в аэробных условиях | ||
| Биопроба (изредка) на кроликах, белых мышах +; Серологическая диагностика |
Род Gluconobacter — глюконобактерии.
По форме клеток бактерии рода Gluconobacter единственного вида G. oxidans очень близки к бактериям рода Pseudomonas (синегнойной палочке).Это микроорганизмы, у которых очень слабая протеолитическая активность и высокая требовательность к питательному субстрату. Поэтому они не врастут на универсальных средах (МПА). Для них характерны окислительный тип метаболизма. Отличительной чертой этой группы бактерий является осуществление процессов неполного окисления, когда в среде накапливаются продукты, окисленные частично, уксусная, глюконовая, фумаровая, молочная, различные кетокислоты. Распространены на растениях, богатых углеводами, в нектаре, вииограде, зрелых фруктах, овощах, в мёде, на пчёлах.
Бактерии рода Gluconobacter используются в промышленности для получения полусинтетического витамина С. Глюконовые кислоты, образуемые бактериями, обладают бактерицидным действием и используются в качестве препаратов для предотвращения послеоперационных осложнений. В парфюмерной промышленности применяется диоксиацетон — продукт неполного окисления глицерина, получаемый также с помощью глюконовых бактерий.
Род Acetobacteraceae — ацетобактерии, уксуснокислые палочки.
Ацетобактерии (уксуснокислые палочки) — бактерии, способные к полному окислению органических субстратов до СО2 и Н2О. В этом случае образовавшаяся уксусная кислота представляет собой лишь промежуточный этап, и после исчерпания из среды исходного субстрата бактерии начинают медленно окислять её. Бактерии этой группы объединены в род Acetobacter, типичным представителем которого является A. aceti. Это мелкие, короткие, подвижные, грамотрицательные палочки, облигатно аэробные организмы, устойчивые к повышенным концентрациям спирта и уксусной кислоты. Иногда встречаются разветвленные формы или клетки соединены в длинные извилистыё цепочки. Отдельные представители (А.peroxydans, A. Rancens, А. pasteurianum) отличаются друг от друга морфологически и физиологически. Ацетобактерии менее требовательны к питательным средам, чем бактерии рода Gluconobacter. На обогащенном МПА образуют блестящие жёлтые колонии.
Ацетобактерии широко распространены в природе. Их можно обнаружить в нектаре цветов, на ягодах, сладких фруктах. В прокисших соках, пиве, вине, квашеных овощах уксуснокислые бактерии растут на поверхности, образуя серовато-белую плёнку. Специфическими переносчиками уксуснокислых бактерий служат маленькие красноватые мушки Drosophyla (дрозофилы), в большом количестве встречающиеся там, где имеются плодовые отбросы. Уксуснокислые бактерии часто развиваются вслед за дрожжами, используя продукт спиртового брожения как субстрат для роста.
Уксуснокислые бактерии используются в промышленности для получения натурального спиртового уксуса (продуцент Acetobacter aceti), винного уксуса (из вина) и яблочного уксуса (из яблочного сока). Также они являются вредителями спиртового, пивоваренного, консервного производств, виноделия, производства безалкогольных напитков. При развитии в пиве, вине, хлебном тесте вызывают скисание и порчу продуктов. A. xylinum — это единственный прокариотический организм, который синтезирует растительную целлюлозу. Ацетобактерии входят в состав, кефирного грибка, кумысной закваски, чайного гриба, придавая соответетвующим пищевым продуктам полезные для здоровья свойства. Они выделяют антибиотикоподобные вещества, подавляющие жизнедеятельность кишечных и гнилостных микроорганизмов.
Представляет собой прочный пищевой симбиоз бактерий A. xylinum, G. oxydans и дрожжевых грибов. Слоевище гриба образует A. xylinum. В нижней части, в темноватых пластах обитают дрожжи, а в верхней, покрытой целлюлозной оболочкой, — G. oxydans. Для культивирования чайного гриба необходима заварка чая с добавлением сахара. Чай — источник биологически активных веществ, сахароза — единственный источник углеродного питания. Фермент чайного гриба левансахараза расщепляет сахарозу до гексоз. Гексозы частично используются бактериями G. oxydans, а частично дрожжами, которые при этом накапливают витамины и этиловый спирт, потребляемый уксуснокислыми бактериями A. xylinum. Культуральная жидкость чайного гриба представляет собой целебный напиток, содержащий глюконовую, 2,5-оксиглюконовую кислоты. Его рекомендовала тибетская медицина при лечении заболеваний желудка, горла и т.д.
Дата добавления: 2014-12-27 ; просмотров: 1555 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Кузнецова Марина Валентиновна, Павлова Ю. А., Карпунина Т. И., Демаков В. А.
В работе представлен сравнительный анализ использования традиционных бактериологических и молекулярных методов для идентификации P. aeruginosa. Для генетической детекции применяли полимеразную цепную реакцию с родои видоспецифичными праймерами, а также амплификацию консервативных участков генов 16S рРНК с последующей идентификацией бактерий путем секвенирования . Установлено, что 95% (151) штаммов соответствуют виду P. aeruginosa, определенному в первичных бактериологических лабораториях и только 8 штаммов не являлись синегнойной палочкой. Большую часть из них составили близкородственные виды: 2 изолята принадлежали к этой же Pseudomonas aeruginosa group, три изолята к Pseudomonas putida group. 2 штамма принадлежали к роду Comamonas, 1 изолят к виду Stenotrophomonas maltophilia. Показана эффективность культурального метода лабораторной диагностики инфекций, обусловленных P. aeruginosa, что не исключает использование молекулярно-генетических технологий в сложных, арбитражных случаях бактериологического анализа при мониторинге нозокомиальных инфекций.
Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Кузнецова Марина Валентиновна, Павлова Ю.А., Карпунина Т.И., Демаков В.А.,
THE EXPERIENCE OF APPLYING TECHNIQUES OF MOLECULAR GENETICS IN >The article presents comparative analysis of application of common bacteriologic and molecular techniques to identify P. aerugenosa. The genetic detection was applied using polymerase chain reaction with genus-specific and species-specific primers and amplification of conservative sites of gens 16S pRNA with successive identification of bacteria by sequenation. It is established that 95% (151) of strains correspond to species of P. aerugenosa detected inprimary bacteriologic laboratories and only 8 strains were not blue pus bacillus. Most of strains were closely congenial species: 2 isolates belonged to Pseudomonas aeruginosa group, 3 isolates to Pseudomonas putida group, 2 strains to Comamonas species and1 isolate to Stenotrophomonas maltophilia species. The effectiveness of cultural technique of laboratory diagnostic was demonstrated concerning infections conditioned by P. aerugenosa. This conclusion does not eliminate application of molecular genetic trechnologies in complicated arbitral cases of bacteriologic analysis during monitoring of nosocomial infections.
Текст научной работы на тему «Опыт использования методов молекулярной генетики при идентификации клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa»
© коллектив авторов, 2013
M. B. Кузнецова1, 2, Ю. А. Павлова2, Т. И. Карпунина1, в. А. Демаков2
Опыт использования методов молекулярной генетики при идентификации клинических штаммов PSEUDOMONAS AERUGINOSA
1ГБОУ вПО Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е. А. вагнера минздравсоцразвития России, 2ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
В работе представлен сравнительный анализ использования традиционных бактериологических и молекулярных методов для идентификации P. aeruginosa. Для генетической детекции применяли полимеразную цепную реакцию с родо- и видоспеци-фичными праймерами, а также амплификацию консервативных участков генов 16S рРНК с последующей идентификацией бактерий путем секвенирования. Установлено, что 95% (151) штаммов соответствуют виду P. aeruginosa, определенному в первичных бактериологических лабораториях и только 8 штаммов не являлись синегнойной палочкой. Большую часть из них составили близкородственные виды: 2 изолята принадлежали к этой же Pseudomonas aeruginosa group, три изолята — к Pseudomonas putida group. 2 штамма принадлежали к роду Comamonas, 1 изолят — к виду Stenotrophomonas maltophilia. Показана эффективность культурального метода лабораторной диагностики инфекций, обусловленных P. aeruginosa, что не исключает использование молекулярно-генетических технологий в сложных, арбитражных случаях бактериологического анализа при мониторинге нозокомиальных инфекций.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, идентификация, ПЦР-диагностика, секвенирование
M.V. Kuznetsova, Yu.A. Pavlova, T.I. Karpunina, V.A. Demakov
THE EXPERIENCE OF APPLYING TECHNIQUES OF MOLECULAR GENETICS IN IDENTIFICATION OF CLINICAL STRAINS PSEUDOMONAS AERUGINOSA
The article presents comparative analysis of application of common bacteriologic and molecular techniques to identify P. aerugenosa. The genetic detection was applied using polymerase chain reaction with genus-specific and species-specific primers and amplification of conservative sites of gens 16S pRNA with successive identification of bacteria by sequenation. It is established that 95% (151) of strains correspond to species of P. aerugenosa detected inprimary bacteriologic laboratories and only 8 strains were not blue pus bacillus. Most of .strains were closely congenial species: 2 isolates belonged to Pseudomonas aeruginosa group, 3 isolates to Pseudomonas putida group, 2 strains to Comamonas species and1 isolate to Stenotrophomonas maltophilia species. The effectiveness of cultural technique of laboratory diagnostic was demonstrated concerning infections conditioned by P. aerugenosa. This conclusion does not eliminate application of molecular genetic trechnologies in complicated arbitral cases of bacteriologic analysis during monitoring of nosocomial infections.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, identification, polymerase chain reaction diagnostic, sequenation
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) относится к одному из самых распространенных возбудителей внутрибольничных инфекций, создающих серьезные проблемы в медицинской практике, и в первую очередь в отделениях реанимации и интенсивной терапии [4, 5, 12]. Синегнойная палочка может поражать различные органы и ткани, а инфицирование легких и сердца при попадании возбудителя в кровоток приводит к смертельному исходу в 25% случаев [20].
Идентификация синегнойной палочки в практических бактериологических лабораториях осуществляется культуральным методом, согласно приказу Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» и «Методическим рекомендациям по определению грамотрица-тельных бактерий потенциально-патогенных бактерий — возбудителей внутрибольничных инфекций» Минздрава РСФСР от 03.06.86. У бактериологов не вызы-
Кузнецова Марина Валентиновна, канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. хим. мутагенеза, доц. каф. микробиологии и вирусологии Адрес: 614081, Пермь, ул. Голева, 13 Телефон: (342)212-44-76 E-mail: mar@iegm.ru
вает затруднений верификация пиоцианинпозитивных штаммов, дающих при росте сине-зеленое окрашивание среды, тогда как беспигментные варианты P. aeruginosa не всегда могут быть определены. Для видовой идентификации P. aeruginosa и других неферментирующих бактерий используют различные неинструментальные и автоматизированные диагностические системы. Оценка эффективности идентификации бактерий группы не-ферментирующих с помощью тест-систем, проведенная в различных лабораториях, дала долю правильной идентификации 77-90% и выше для разных видов бактерий. Проведение дополнительных биохимических тестов повышает ее до 95-96% [1].
Идентификацию бактерий с помощью молекулярно-генетических методов чаще всего осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции. Для выявления P. aeruginosa предложены специфические праймеры детекции algD-гена, кодирующего GDP-дегидрогеназу, участвующую в продукции альгината у этого вида бактерий, toxA-гена, кодирующего экзотоксин А, gyrB-гена и ес!Х-гена [10, 13, 14, 16]. Возможна одновременная амплификация («multiplex-PCR») генов oprl и oprL, экспрессирующих синтез двух липопротеинов наружной мембраны, маркирующих флюоресцентную группу псевдомонад и P. aeruginosa соответственно [11]. Молекулярной мишенью могут служить нуклеотидные последовательности, кодирующие участки генов 16S рРНК [8, 18, 19]. Показана эффективность использо-
вания нескольких пар праимеров для выявления синегноИноИ палочки [6]. В настоящий момент нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и соответствующие прайме-ры для идентификации Р. aeruginosa. Опыт ряда исследователей показывает, что молекулярные методы могут быть как единственным, так и дополнительным быстрым и надежным тестом для идентификации Р. aeruginosa [3].
Цель данной работы — оценить клиническую целесообразность использования молекулярных методов диагностики для идентификации но-зокомиальных штаммов Р. aeruginosa.
Материалы и методы. В работе использовали 159 штаммов Р. aeruginosa, выделенных в 2008-2011 гг. от больных и из больничной среды крупных хирургических стационаров. В качестве положительного контроля использовали штамм Р. aeruginosa АТСС 27853, отрицательного -лабораторный штамм Рseudomonas fluorescens С32. Первичная идентификация проведена в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Реидентификацию осуществляли с помощью Неферм-Теста24 («Lachema», Чехия) в соответствии с инструкцией производителя. Пигментообразование определяли визуально при росте культур на плотной агаризованной среде Луриа-Бертани и Кинга («Sigma-Aldrich Со», США).
Молекулярно-генетические исследования проводили методом ПЦР с использованием родо- ^-Нот^-гсу) и видоспецифичных (РА^-Р/РА^-Я) праймеров, а также универсальных праймеров к 16S рРНК (515F/1391R) (табл. 1). Отдельную колонию каждого штамма ресу-спендировали в 500 мкл сверхчистой воды, инкубировали в твердотельном термостате «Термит» (Россия) в течение 10 мин при 95oC и центрифугировали 5 мин при 13 000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для генетических исследований. Протоколы амплификации соответствовали рекомендациям авторов, предложивших используемые праймеры [8, 18, 19]. Температура отжига для праймеров Рs-for/Рs-rev: 65oC — 60 с; для РА^РА^-Я: 58oC — 20 c; для универсальных праймеров 515F/1391R: 56oC — 40 c. Электрофоретиче-ское разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряже-
Праймеры, использованные в ПЦР-анализе
Выявляемый вид, последовательность Праймер Нуклеотидная последовательность Размер фрагмента, п.н. Источник литературы
Fseudomonas spp. Ps-for Ps-rev 5′-GGTCTGAGAGGATGATCAGT 5′-TTAGCTCCACCTCGCGGC 969 [19]
Р. aeruginosa PA-SS-F PA-SS-R 5′-GGGGGATCTTCGGACCTCA 5′-TCCTTAGAGTGCCCACCCG 956 [18]
16S рРНК универ-
515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 876 [8]
Рис. 1. Пример электрофореграммы продуктов амплификации 16S рДНК с прай-мерами Ps-for/Ps-rev (верх) и PA-SS-F/PA-SS-R (низ): 1 — маркер молекулярных масс O’GeneRulerTM 1 кЬ Plus DNA Ladder ("Fermentas", Литва); 2-17 — клинические изоляты.
нии электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze («Biometra», Германия).
Секвенирование гена 16S рРНК проводили с прай-мерами, используемыми в ПЦР, с применением набора реактивов SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе 3500xL Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). Температурный режим секвенирующей реакции: 95oC — 1 мин; 95oC — 10 c; 50oC — 10 с; 60oC — 4 мин, 25 циклов. Полученные последовательности идентифицировали с помощью программы BLAST и базы данных GenBank/EMBL/DDBJ (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov). Далее нуклеотидные последовательности 16S рДНК изучаемых изолятов сравнивали с последовательностями типовых штаммов близкородственных видов с помощью пакета программ TREECON, version 1.3b.
Результаты и обсуждение. Реидентификация с использованием НефермТеста24 выявила, что 17 штаммов не принадлежали к Р. aeruginosa и по его результатам были отнесены к видам Pseudomonas putida, Ochromobacter anthropi, Burkholderia pseudomallei.
В результате генетической идентификации с помощью родо- и видоспецифичных праймеров было установлено, что 145 (91,2%) штаммов соответствуют виду P. aeruginosa, определенному в первичных бактериологических лабораториях. По результатам ПЦР-анализа 11 (6,9%) культур являются псевдомонадами, но не синегнойной палочкой и только 3 (1,9%) — не принадлежали к роду Pseudomonas (рис. 1). ДНК штаммов (n = 14), с матрицы которых не прошла специфическая амплификация с видоспецифичными праймерами, была использована в ПЦР с универсальными праймерами к гену 16S рРНК (515F/1391R). Проведено определение полученных нуклеотид-ных последовательностей.
BLAST-анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК подтвердил, что 11 штаммов являются представителями рода Pseudomonas
Рис. 2. Филогенетическое древо, построенное с помощью пакета программ TREECON, основанное на сравнении нуклеотид-ных последовательностей 16S рДНК видов рода Pseudomonas и некоторых видов ß- и y-ß-субклассов Proteobacteria. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов.
(рРНК группы I) [7]. На филогенетическом древе изоля-ты попали в разные подгруппы псевдомонад: 6 штаммов имели максимальный уровень сходства с P. aeruginosa, 2 штамма принадлежали к этой же Р. aeruginosa group и определены как Pseudomonas pseudoalcaligenes/ Pseudomonas nitroreducens (табл. 2, рис. 2). Точная видовая идентификация была невозможна из-за малой длины секвенированнного фрагмента. У трех изолятов исследуемые участки ДНК были на 99,9% схожи с геном 16S pPHK штамма Pseudomonas plecoglossicida FPC951 (GenBank АВ009457.1) из Pseudomonas putida group. Таким образом, 6 штаммов оказались P. aeruginosa, как они и были определены в первичных бактериологических лабораториях, а остальные принадлежали к близкородственным группам наиболее клинически значимых псевдомонад. Один изолят принадлежал к виду Stenotrophomonas maltophilia (рРНК группы V), выделенному (реклассифицированному) ранее N. Palleroni и J. Bradbury [17] в самостоятельный род. У 2 штаммов анализируемые нуклеотидные фрагменты имели максимальное сходство с геном 16S pPHK штамма comamonas sp. ЕВ172 LMG 5323 (GenBank AJ430348.1, семейство comamonodaceae, рРНК группы III).
Таким образом, наши результаты показали высокую достоверность видовой идентификации P. aeruginosa при использовании культурального метода исследования и с учетом ложноотрицательных данных ПЦР-анализа она составила 95%. Следует также подчеркнуть, что почти все штаммы, отнесенные нами по 16S рРНК к другим видам, являются близкородственными и подобные лабораторные "ошибки" при использовании бактериологического метода исследования существенного клинического значения не имеют. Исключение представляет единственный случай "недодиагностики" инфекции,
вызванной S. таИюрЫНа, значимость которых в качестве возбудителя нозокомиальных инфекций выросла в последнее время. Известно, что инфекции, вызванные S. таИюрЫНа, очень трудно контролировать, так как клинические изоляты часто резистентны ко многим антимикробным препаратам [1]. Выбор антибиотиков в подобных случаях представляет большую проблему и для бактериологов, и для клиницистов, а дополнительные сложности связаны с методологией проведения тестов чувствительности. Быстрая видовая идентификация природно-устойчивого к карбапенемам микроорганизма может быть залогом успешного исхода для больного.
Заключение. Внедрение в практику метода ПЦР существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой в России до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах.
Молекулярные технологии позволяют не только выявлять детерминанты антибиотикорезистентности и специфичные факторы патогенности, проводить внутривидовое типирование штаммов, но и точно идентифицировать изоляты. Опыт использования в подобных случаях амплификации консервативных участков генов 16S рРНК и последующей идентификации бактерий путем секвенирования продуктов реакции описан в зарубежной практике. В России современный уровень развития клинической лабораторной диагностики не позволяет использовать все возможности ПЦР в одном конкретном лечебном учреждении. Более того, актуальным является вопрос о клинической целесообразности такого подхода.
Наши экспериментальные исследования показали эффективность методов "классической бактериологии",
Анализ нуклеотидной последовательности фрагментов генов 16S рДНК
Обозначение штамма Размер секвени-рованного фрагмента, п.н. Сходство с наиболее близким гомологичным геном 16S рРНК из GenBank %
Pr7 784 P. aeruginosa LMG 1242T, Z76651.1 100
Сметное дело и ценообразование в строительстве. Расчет смет.
Период обучения:
15 января — 5 марта 2019 года
Информационный бюллетень БУДСТАНДАРТ Online. Выпуск №3 2019 года
ДБН В.2.2-41:2019 Высотные здания. Основные положения
Перечень документов, которые отменены 1 октября 2019 года
Переименовали Министерство регионального развития, строительства и жилищно-коммунального хозяйства
Обновленный Порядок разработки проектной документации на строительство объектов
Расчет нормы продолжительности рабочего времени на 2020 год
Реорганизация Министерства энергетики и угольной промышленности
Для работы с текстом документа
(печать документа, поиск по тексту)
необходимо авторизоваться.
Сервис содержит 18711 бесплатных документов, которые доступны зарегистрированным пользователям. Регистрируйся бесплатно >>>
- Информация о документе
- Ссылки на документы
- Ссылки из других документов
| Наименование документа | Методические рекомендации. Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях) |
| Дата принятия | 24.05.1984 |
| Статус | Действующий |
| Вид документа | Рекомендации |
| Разработчик | Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана |
| Принявший орган | Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана |
В данном документе нет ссылок на другие нормативные документы.
Другие нормативные документы не ссылаются на данный документ.
ОБНАРУЖЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
(ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, ВОДЕ, СТОЧНЫХ ЖИДКОСТЯХ)
Методические рекомендации разработаны сотрудниками Московского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (Г.П.Калина, Г.М.Трухина, Н.Б.Комзолова, Т.И.Графова).
Ответственный редактор — академик АМН СССР А.П.Шицкова.
Рассмотрены Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР и рекомендованы к утверждению для внедрения в практику лабораторий НИИ и для использования по показаниям в бактериологических лабораториях республиканских, краевых, областных санэпидстанций.
УТВЕРЖДЕНЫ Начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР В.П.Сергиевым 24 мая 1984 г.
В последние годы возрастает значение Ps. aeruginosa в патологии человека. Обнаружение Ps. aeruginosa в объектах окружающей среды сигнализирует одновременно об эпидемическом (как патоген) и санитарном (как индикатор биологического загрязнения) неблагополучии. Известны острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии водного происхождения и различные формы заболеваний (отиты, поражения кожного покрова) у купающихся в бассейнах, септические заболевания грудных детей с летальным исходом в результате купания в питьевой воде централизованного водоснабжения, содержавшей Ps. aeruginosa.
Описаны вспышки пищевых токсикоинфекций псевдомонадной этиологии и обнаружение Ps. aeruginosa в пищевых продуктах, особенно богатых белками (мясо, рыба), что характеризует последние как возможный источник пищевой токсикоинфекции. Острые кишечные инфекции псевдомонадной этиологии клинически протекают в виде диаррей той или иной тяжести, особенно тяжело у детей, пожилых людей и больных хроническими заболеваниями, а при пищевых токсикоинфекциях — со всеми признаками этиопатогенеза этого типа заболеваний.
В то же время, в природе существует до 200 видов псевдомонад — сапрофитов или фитопаразитов, не представляющих медицинский или санитарный интерес, и широкое применение простых надежных способов отличия Ps. aeruginosa от этих видов приобретает большое практическое значение.
Настоящие методические рекомендации предназначены для использования в практике бактериологических лабораторий гигиенического и эпидемиологического профиля и распространяются на объекты окружающей среды — пищевые продукты, воду централизованного снабжения и водоемов, используемых в качестве источников централизованного, хозяйственно-питьевого водоснабжения или для рекреационных целей (плавательные бассейны, бани, прибрежные воды курортных мест, минеральные воды, используемые для питья и лечебных процедур, смывы с посуды, инвентаря и рук персонала общественного питания).
Методические рекомендации не распространяются на патологический материал при внутрибольничных инфекциях и на предметы окружения больных, воздух больничных помещений, лекарственные средства, методы исследования которых на Ps. aeruginosa существенно отличаются от методов, применяемых при исследованиях окружающей среды. Разница методических приемов определяется:
а) необходимостью при исследованиях окружающей среды использовать преимущественно предварительное накопление Ps. aeruginosa в самом исследуемом материале или среде накопления, в то время, как при исследованиях патологического материала и предметов окружения больных применяют, как правило, непосредственный посев на плотные селективно-дифференциальные среды;
б) малой результативностью сред, эффективность которых доказана при исследованиях патологического материала, при использовании применительно к объектам окружающей среды;
в) различиями Ps. aeruginosa, обнаруживаемых в объектах окружающей среды, от выделяемых из патологического материала и окружения больных, по большей стабильности культуральных, биологических и биохимических свойств, меньшей частоте утраты пигмента феназина (смеси пигментов цианина, рубрина, меланина), в результате чего идентификация штаммов Ps. aeruginosa, выделяемых из объектов окружающей среды, значительно упрощается.
Предлагаемая схема исследования и идентификации Ps. aeruginosa применительно к объектам окружающей среды впервые разработана в СССР, а за рубежом имеются лишь отдельные рекомендации или стандартные методы исследования отдельных объектов — воды, пищевых продуктов, почвы, без объединения в общую универсальную сводку методических приемов.
1. Лабораторное оборудование, реактивы, материалы
1.1. Лабораторное оборудование
1.1.1. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. ГОСТ 25336-82 (СТ СЭВ 2945-81).
1.1.2. Проволока из никелевого и медноникелевых сплавов для удлиняющих проводов к термоэлектрическим преобразователям. ГОСТ 1791-67.
1.2. Основы питательных сред.
1.2.1. Агар микробиологический. ГОСТ 17206-71*.
1.2.2. Дрожжи хлебопекарные прессованные. ГОСТ 171-81.
1.2.3. Молоко коровье пастеризованное. ГОСТ 13277-79*.
1.2.4. Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. ГОСТ 13805-76.
1.3.1. Альфа нафтол. ГОСТ 5838-79.
1.3.2. Диметил-пара-фенилондиамин. ТУ 6-09-18-28-72.
1.3.3. Калия гидроокись. ГОСТ 24363-80.
1.3.4. Карбонат кальция. ГОСТ 4530-76.
1.3.5. Калий азотнокислый. ГОСТ 4144-79.
1.3.6. Калий сернокислый. ГОСТ 4145-74.
1.3.7. Магний сернокислый 7-водный. ГОСТ 4523-77.
1.3.8. 2-, 3-, 5-трифенилтетразол хлористый. ТУ 6-09-3838-74.
1.3.9. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. ГОСТ 2493-75.
1.3.10. Натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный 4-водный. ТУ 4170-78.
1.3.11. Магний хлористый, 6-водный. ГОСТ 4209-77.
1.3.12. Натрий хлористый. ГОСТ 4233-77.
1.3.13. * -аргинин гидрохлорид. ТУ 6-09-2100-72.
1.3.14. Натрий лимоннокислый трехзамещенный. ГОСТ 22280-76.
1.4. Углеводы и спирты.
1.4.1. Глицерин. ГОСТ 6824-76.
1.4.2. Д-глюкоза. ГОСТ 6038-79.
1.4.3. Ксилоза. ТУ 6-09-20-45-77.
1.4.4. Мальтоза. ВТУ 257-59.
1.5. Красители, индикаторы.
1.5.1. Бромтимоловый синий. ТУ 6-09-2045-77.
1.5.2. Кристаллический фиолетовый. ТУ 6-09-4119-75.
1.5.3. Феноловый красный. ГОСТ 4599-73.
2. Питательные среды
2.1. Питательные среды обогащения первого этапа. Различны в зависимости от исследуемого объекта, их выбор определяется уровнем и составом усвояемых компонентов в исследуемом объекте.
2.1.2. Минеральная среда Бонде (модификация). Трехзамещенного цитрата натрия 0,28 г, фосфата натрий- аммония 0,15 г, однозамещенного фосфата калия 0,1 г, сульфата магния 0,02 г, дист. воды до 100,0 мл. Стерилизация при 1 атм. 20 мин. Непосредственно перед посевом прибавить 2,0 мл 0,01% водного р-ра кристаллического фиолетового.
2.1.2. Концентрат среды Бонде. Все компоненты, кроме воды в 10-кратном размере. Концентрат прибавлять к объекту в соотношении 1:10.
2.1.3. Среда с хлоридом трифенилтетразола (ТТХ): пептона 2,0 г, дрожжевого экстракта по Г.Г.Калине* 15 мл (или сухого 0,3 г, двузамещенного фосфата калия 0,2 г, ТТХ 0,8 г, воды дист. до 100,0 мл. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, pH 7,1.
2.1.4. Дрожжевой экстракт жидкий по Г.Г.Калине*.
2.1.5. 8% водный раствор ТТХ в дистиллированной воде. В жидкие объекты прибавляют в соотношении 1:10.
2.2. Селективно-дифференциальная среда (СДС) второго этапа.
2.2.1. Среда "Блеск". Мясопептонного стерильного 2% агара 100,0 мл, молока нормализованного 10,0 мл, 10% водного раствора трифенилтетразола хлорида 8,0 мл, L-аргинина гидрохлорида 0,3 г, в расплавленный мясопептонный агар прибавить аргинин, р-р трифенилтетразол хлорида (самостерилизуется после хранения при комнатной температуре 2-3 дня) и стерильное снятое молоко размешать, разлить в 6-7 чашек.
2.2.2. При отсутствии мясопептонного агара возможно применение упрощенного варианта среды "блеск": к 100,0 мл дистиллированной воды прибавить питательный сухой агар Дагестанского НИИ питательных сред, после стерилизации при 0,5 атм., 15 мин, внести 10,0 мл стерильного снятого молока и 8,0 мл 10% водного р-ра трифенилтетразола хлорида, смешать, разлить в 6-7 чашек. Следует учесть, что такая упрощенная среда несколько теряет в интенсивности образования блеска (вместо сплошного золотистого налета колонии содержат мелкие золотистые вкрапления или ободок по периметру колонии).
2.3. Среды и тесты идентификации.
2.3.1. Среда Кинг-А. Пептон 2,0 г, агар 1,5 г, глицерин — 1,0 г, сульфат калия 1,0 г, хлорид магния 0,14 г, вода дистиллированная до 100,0 мл pH 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.
2.3.3. Среда для определения оксидации мальтозы. Пептон 0,2 г, хлорид натрия 0,5 г, мальтоза 2,0 г, 1,6% спиртовой или щелочной раствор бромтимолового синего 1,0 мл, вода дистиллированная до 100,0 мл pH 7,2. Стерилизация при 0,5 атм. 15 мин, разлить в 6 чашек.
2.3.4. Среда для определения теста Хью и Лейфсона (оксидация, ферментация). Модификация в одной пробирке. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 5,0 г, глюкоза 5,0 г, К2НРО4 0,3 г, агар — 4,0-6,0 г, 1,6% р-р фенолового красного 2,5 мл, вода 1000,0 мл. После растворения в водяной бане или автоклаве разлить в пробирки ровно высотой столбика 6 см (независимо от диаметра пробирки), стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.
2.3.5. Среда для определения нитрат-нитритредуктазы и роста при 42 °С. Пептон 2,0 г, хлорид натрия 0,5 г, нитрат калия 0,2 г, агар 0,1 г, дрожжевой экстракт жидкий 20,0 мл, вода 80,0 мл (дрожжевой экстракт и вода могут быть заменены мясопептонным бульоном, в этом случае содержание пептона уменьшить до 1,0
г). После растворения компонентов в водяной бане разлить в пробирки по 4-5 мл, стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин, застудить столбиком.
2.3.6. Реакция цитохромоксидазы по Гэби и Хедли. В СССР принят метод определения цитохромоксидазы с использованием диметилпарафенилендиамина (пара-аминодиме….*аланина хлорида или оксалата), который в сочетании с альфанафтолом образует за счет оксидации цитохрома индофеноловый синий. 1% водный раствор реактива смешать с 1% спиртовым раствором альфа-нафтола в пропорции 2:1 непосредственно перед применением. Хранение обоих реактивов обязательно раздельно в холодильнике. Смесь реактивов наносят петлей (платиновой или нихромной, но не железной) на периферический участок макроколонии на среде Кинг-А или на изолированную колонию на среде "блеск". Пигментированные колонии на среде Кинг-А и покрытые золотистым налетом на среде "блеск" предпочтительно наносить на фильтровальную бумагу, смоченную смесью реактивов. Положительный результат — посинение колонии или мазка на фильтровальной бумаге в течение 20-40 секунд. Позднюю реакцию, как и посинение агаровой среды, не учитывать.
2.3.7. Тест Грегерсена. Простой, быстрый способ, заменяющий окраску по Граму и не требующий оптики. В капле 3% водного р-ра КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры или колонии к грам-отрицательному виду. У грам-положительных микробов, за редкими исключениями, реакция отрицательна.